Для идентификации биологического материала используют

Идентификация образцов биологического материала с использованием ЛИС

Важнейшей процедурой первичной обработки образцов биологического ма­териала после взятия их у пациентов является их кодирование с целью последую­щей идентификации. Идентификация образцов от определенных пациентов наи­более рациональна с помощью штрих-кода.

Пробы, содержащие опасные инфекционные агенты, должны быть промар­кированы иначе, чем обычный биологический материал.

Маркировка биологического материала с помощью штрих-кода практически сводит к нулю вероятность ошибки при идентификации образца и вида исследо­вания. Исключается дублирование заказов на лабораторные исследования. Со­кращается число медицинского персонала, занятого в утренние часы сортиров­кой образцов биологического материала.

После ввода в компьютер заявок на лабораторные исследования формируют­ся и распечатываются этикетки со штрих-кодами. Медицинский персонал наклеи­вает их на одноразовые пробирки заранее или во время взятия материала.

Для удобства каждому виду исследования соответствует определенный цвет этикетки. Сразу после взятия биологического материала штрих-код пробирки считывается ручным сканером для регистрации времени взятия материала. При поступлении пробирок в лабораторию сканируется время доставки материала.

Использование для маркировки пробирок штрих-кодов позволяет заметно упростить регистрацию времени взятия и доставки материала в лабораторию. Для этого в кабинете взятия и доставки биологического материала могут исполь­зоваться настольные сканеры, а у лаборантов, производящих взятие крови, руч­ные переносные сканеры штрих-кодов. При взятии материала, сразу после наклейки

этикетки на пробирку, достаточно поднести штрих-код к сканеру и время взятия материала сразу попадает в ЛИС. Если сканер переносной, данные сохраняются в его памяти и в последующем передаются в ЛИС.

Для работы с амбулаторными пациентами могут использоваться заранее подготовленные наклейки со штрих-кодами, напечатанные в типографии, а для работы с заказами из других лечебно-профилактических учреждений можно ис­пользовать специальные бланки с этикетками штрих-кодов. В полях бланков впи­сываются Ф.И.О. пациента и перечень необходимых исследований. Этикетки на­клеиваются на пробирки при взятии биологического материала.

При поступлении бланков в лабораторию в ЛИС регистрируются паспорт­ные данные пациентов, указываются коды на наклейках пробирок, а также вво­дятся заявки на исследования.

Пациентам поликлиники, проходящим профилактические осмотры, этикетки со штрих-кодами могут выдаваться в регистратуре. При сканировании предъявлен­ных этикеток автоматически формируются заявки на лабораторные исследования.

Штрих-код пробирки автоматически задается при назначении пациенту ис­следований врачом-клиницистом или лаборантом. За каждым исследованием за­крепляется определенный штрих-код.

1. Виды штрих-кодов, рекомендуемых к использованию в КДЛ (рис. 1):

a. для стационарных больных;

b. для амбулаторных пациентов;

c. для внешних заказов.

2. Каждый из штрих-кодов содержит следующую информацию:

3. Порядковый номер пациента.

4. Коды лабораторных исследований.

5. Ф.И.О. и местонахождение пациента.

6. Код пациента в день исследования.

7. Идентификатор группы исследований (цифра 1 на рисунке – номер иссле­дования за день).

8. Номер амбулаторной карты пациента.

10. Штрих-код без незначащих нулей.

11. Наименование группы исследований.

15. Мержиевский Н.П. Травматологическое П.5

0000024 И 237 238

15. Мержиевский Н.П. Травматологическое П.5

Что такое генетическая идентификация личности и зачем она нужна

Что такое генетическая идентификация личности?

И как учёные находят эти различия?

А как сравнивают фрагменты ДНК?

Это, наверное, очень долго?

А где берут эти реагенты и оборудование?

Где применяются такие методы?

Значит, генетическая идентификация нужна только криминалистам?

Зачем использовать её чаще?

Объясняем простыми словами, как ДНК помогает раскрывать преступления и разгадывать тайны истории.

Что такое генетическая идентификация личности?

Это определение генетического профиля человека, с помощью которого можно понять, кому принадлежит кровь, слюна или другой биологический материал, а также выяснить степень родства двух людей.

В ядре каждой клетки тела есть спираль ДНК, в которой хранится генетическая информация. Можно представить её как огромную инструкцию, по которой будет построено тело человека. Книга ДНК написана четырьмя буквами-нуклеотидами. Это органические соединения, состоящие из углевода дезоксирибозы, остатка фосфорной кислоты и четырёх вариантов азотистых оснований: A (аденин), G (гуанин), T (тимин) и C (цитозин).

Геном всех людей идентичен на 99,9%. Если представить, что инструкция ДНК состоит из 500 листов, в двух разных томах не будет совпадать текст всего одной страницы. Притом эти вариации не сосредоточены в одном месте, а разбросаны по всей книге. Именно они определяют уникальность человека и позволяют найти его среди миллиардов других.

И как учёные находят эти различия?

Учёные не просматривают книгу ДНК целиком — это долго, дорого и не нужно, ведь необходимо найти всего лишь 0,1% различий. Вместо этого сравнивают отдельные странички ДНК — локусы, в которых чаще всего встречаются индивидуальные элементы. Определённый вариант странички называется аллелью.

Чаще всего анализируют микросателлитные локусы (short tandem repeats — STR). Это фрагменты ДНК с повторяющимся паттерном нуклеотидов, например tgtgtgtgtg или aacaacaac. Последовательность нуклеотидов одинаковая у всех людей, а вот количество таких tg или aac и, соответственно, длина локуса — разные.

Если вернуться к аналогии с литературой, получится, что учёные знают, на каких страничках чаще всего встречаются различия. Они сразу смотрят на нужные фрагменты ДНК: сравнивают одну и ту же страничку из книги преступника и книги крови на месте преступления и делают выводы.

А как сравнивают фрагменты ДНК?

Процедура проходит в несколько этапов.

1. С помощью реагентов из образца биоматериала выделяют ДНК. Можно делать это вручную или в автоматическом режиме. Конкретный набор реагентов зависит от того, какой материал у вас есть: следы крови, волосы, сперма, сигаретные окурки или что-то другое.

2. Оценивают количество и качество ДНК в материале. Для этого применяют специальные наборы с очень чувствительной ПЦР-смесью (ПЦР — полимеразная цепная реакция). Она позволяет определить, человеческая ли это ДНК, достаточно ли её для дальнейших исследований и насколько она разрушена. После реакции данные анализирует компьютерная программа. Если ДНК слишком мало или она сильно повреждена, в лаборатории не будут понапрасну тратить реагенты.

3. Проводят полимеразную цепную реакцию. С помощью реагентов и разных температур создают много копий нужных локусов — тех самых страничек, на которых должны быть различия. Эта процедура называется амплификацией.

Набор реагентов для генетической идентификации личности и установления родства «иксМарк» производства «Ниармедик»

4. В генетический анализатор загружаются плашки с размноженными локусами ДНК, аппарат анализирует их и выдаёт файл с результатами. Теперь у экспертов есть генетический профиль человека и они могут сравнивать его с другими результатами ДНК-типирования.

Это, наверное, очень долго?

Раньше генетическая идентификация действительно проходила долго, поскольку был только один способ найти различия в ДНК — рестрикционный анализ.

Фермент рестриктаза разрезает спираль ДНК на фрагменты. Причём не где попало, а только там, где есть определённая последовательность нуклеотидов. У разных людей длина отрезанных фрагментов будет отличаться. Учёные сравнивают их и определяют, насколько схож исследуемый материал.

Для такого метода нужно много хорошего генетического материала: свежей крови или тканей. О следах с зубной щётки, засохшей крови и уж тем более старых трупах не может быть и речи.

Сегодня за счёт использования ПЦР для генетической идентификации нужно гораздо меньше биоматериала, причём он не обязательно должен быть свежим.

Кроме того, оборудование и реагенты постоянно совершенствуются, делая процедуру всё проще и быстрее. Сегодня результаты генетической идентификации можно получить уже через 8–12 часов после подачи материала.

А где берут эти реагенты и оборудование?

В основном реагенты и оборудование закупают у компаний из США и Германии либо у российских дистрибьюторов. В 2018 году компания «Ниармедик» открыла первое российское производство наборов реагентов для генетической идентификации, которое сертифицировано по мировым стандартам.

Процесс создания компонентов набора на производстве «Ниармедик»

В «Ниармедик» построили своё производство, разработали собственные реагенты и прошли сертификацию на соответствие международным стандартам 9001:2015 Quality management systems — Requirements и ISO 18385 Minimizing the risk of human DNA contamination in products used to collect, store and analyze biological material for forensic purposes — Requirements . Другими словами, компания поставляет такой же качественный продукт, как и зарубежные фирмы. При этом наборы целиком и полностью производятся в России, от синтеза всех составляющих до упаковки.

Запуск автоматической дозирующей станции Fluent 480, Tecan для розлива компонентов набора

Сейчас «Ниармедик» производит наборы реагентов «Скрининг» для создания баз данных и готовится к выпуску наборов «Эксперт» для анализа биоматериала с мест преступлений.

Так что в перспективе процедура идентификации личности в России станет дешевле и сможет использоваться чаще.

Где применяются такие методы?

В первую очередь в криминалистике. На месте происшествия собирают образцы, которые могут содержать ДНК преступника, например окурки, капли крови или волосы. Затем материал отвозят в лабораторию и определяют генетический профиль.

Когда подозреваемый будет задержан, у него возьмут кровь или слюну для анализа и определят генетический профиль. Его сравнят с тем, что нашли на месте преступления, и с данными из государственной базы, где содержится информация о ДНК преступников.

В соответствии с Федеральным законом № 242-ФЗ Федеральный закон «О государственной геномной регистрации в Российской Федерации» от 03.12.2008 № 242-ФЗ (последняя редакция) в базу попадают генетические профили людей, совершивших тяжкие и особо тяжкие преступления, в том числе изнасилования, а также биологический материал, найденный во время следственных действий, и профили неопознанных трупов.

Значит, генетическая идентификация нужна только криминалистам?

Нет, она используется и в других областях.

Генетические исследования помогают биологам анализировать происхождение видов, а антропологам — отслеживать возникновение популяций. Историки могут определить, кому принадлежат тела из обнаруженных захоронений. Например, ДНК-типирование помогло идентифицировать останки членов царской семьи, расстрелянных в революцию.

Читайте также:  Куда можно клеить знак шипы

Ещё одна область применения — установление отцовства. Генетический профиль ребёнка сравнивают с ДНК потенциального родителя. Достаточно проверить около 19 страничек-локусов, чтобы определить степень родства с точностью Экспертиза ДНК до 99,999%.

Также ДНК-типирование используют в медицинских целях: например, анализируют клетки костного мозга при трансплантации.

Зачем использовать её чаще?

Несмотря на обязательный сбор биоматериала на месте преступления, из-за дороговизны процедуры ДНК-типирование проводится далеко не всегда. Чем доступнее реагенты и оборудование, тем больше шансов найти преступника.

Кроме того, сейчас в России довольно скудная база генетической информации, по сравнению с той же Великобританией, где ДНК-дактилоскопию проходит каждый задержанный, или США, где в базе хранится генетическая информация всех военных.

В перспективе увеличенная база ускорит раскрытие преступлений и опознание тел. Так что, возможно, в будущем список групп, подлежащих обязательной геномной регистрации, будет расширен и в России.

Изолирование и идентификация циннаризина в биологических объектах

Изолирование и идентификация циннаризина в биологических объектах / Мансурова Р.Г., Шашин С.Л. // Мат. VI Всеросс. съезда судебных медиков. — М.-Тюмень, 2005.

библиографическое описание:
Изолирование и идентификация циннаризина в биологических объектах / Мансурова Р.Г., Шашин С.Л. // Мат. VI Всеросс. съезда судебных медиков. — М.-Тюмень, 2005.

код для вставки на форум:

Циннаризин (Стугерон, Cerepar, Cinnacet, Midronal и др.) используется в медицине как препарат, улучшающий мозговое, периферическое, коронарное кровообращение и микроциркуляцию. В доступной нам литературе мы не встретили данных о методах изолирования циннаризина из трупного материала. Целью нашего исследования явилась разработка способов выделения циннаризина и его идентификации в биологических объектах. Для разрешения поставленной задачи нами было проведено три серии исследований.

1. Изолирование циннаризина из таблеток.

100 мг измельчённых таблеток встряхивали в колбе с 10 мл хлороформа троекратно по 5-10 минут, через 30 минут фильтровали. Фильтрат исследовали методами хроматографии в тонком слое сорбента, газожидкостной хроматографии, УФ – спектрофотометрии, а также использовали его в качестве стандартного раствора при исследовании извлечений из трупного материала.

2. Исследование извлечения из таблеток.

С реактивом Драгендорфа по Шталю наблюдали оранжевое окрашивание. С реактивом Марки, с 10% раствором хлорного железа окрашивания не наблюдали.

Хроматографию в тонком слое сорбента проводили на пластинках «Сорбфил» – ПТСХ-П-А. Использовали следующие системы растворителей: I – толуол-ацетон-этанол-25% аммиак (45:45:7,5:2,5); II – хлороформ-ацетон-диоксан-25% аммиак (45:5:47,5:2,5); III – этилацетат-метанол-25% аммиак (17:2:1). В качестве проявителя использовали реактив Драгендорфа по Шталю – наблюдали появление оранжевых пятен. Значения Rf: I – 0,76; II – 0,81; III – 0,83.

УФ – спектрофотометрия. В спектре поглощения растворов извлечений в 0,1 н растворе соляной кислоты и в этиловом спирте наблюдали максимумы поглощения при 229 нм, 253 нм и 283 нм и минимумы поглощения при 223 нм, 236 нм, 280 нм и 289 нм.

Газожидкостная хроматография. Газохроматографическое исследование проводили на хроматографе «Кристалл – 2000» с использованием пламенно-ионизационного детектора на стеклянной колонке 100х0,3 см, заполненной хроматоном N-AW-DMCS зернением 0,16-0,20 мм с нанесённой жидкой фазой 5% OV-101. Время удерживания циннаризина 6,23 минут.

Хромато-масс-спектрометрия. Исследование проводили на хроматографе Agilent 6890 Plus, оборудованном масс-селективным детектором Agilent 5973N и капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной фазы 0,25 мкм. Время удерживания циннаризина 18,52 минут (основные ионы m/z = 201, 117, 167, 202, 251, 165, 118, 115).

3. Исследование биологического материала.

Исходя из физико-химических свойств циннаризина, для изолирования его из биологического материала были использованы три метода: а) подкисленной водой по Васильевой; б) водой, подкисленной соляной кислотой; в) подкисленным спиртом по Стасу-Отто. Исследовали искусственную смесь печени с циннаризином. К 25 г печени добавляли по 25 мг циннаризина и оставляли на 24 часа, после чего изолировали вышеописанными методами. Экстракцию проводили из кислой среды при рН=2,0 смесью хлороформ-эфир 2:1, из аммиачной среды при рН=9,0 хлороформом. В извлечениях из щелочной среды циннаризин идентифицировали с использованием физико-химических методов анализа: хроматография в тонком слое сорбента, УФ – спектрофотометрия, газожидкостная хроматография, хромато-масс-спектрометрия.

Количественное определение проводили газохроматографически с использованием метода абсолютной калибровки. Порог чувствительности во вводимой пробе (1 мкл) составлял 0,05 мкг.

Обнаружено, что методом Васильевой изолируется из трупного материала 32 %, водой, подкисленной соляной кислотой – 34 %, методом Стаса-Отто – 89% циннаризина от введённого количества.

Метод изолирования по Стасу-Отто был использован при исследовании секционного материала (печень, почка, желудок, кишечник), подтвердившего эффективность данного метода для доказательства наличия циннаризина.

Анализ результатов проведённого исследования позволил нам придти к следующему заключению.

  1. При судебно-химических исследованиях для изолирования циннаризина из биологического материала целесообразно использовать метод Стаса-Отто.
  2. Для идентификации циннаризина следует применять комплекс физико-химических методов исследования, включающий хроматографию в тонком слое сорбента, газожидкостную хроматографию, спектрофотометрию в ультрафиолетовой области спектра, хромато-масс-спектрометрию.

похожие статьи

Влияние упаковки на сохраняемость летучих веществ / Исаков В.Д., Горбачева Т.В., Фокин М.Б., Сайгушкин Н.В. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2018. — №5. — С. 31-34.

Идентификация, сравнение образцов, типирование

Наша команда профессионалов ответит на ваши вопросы

Пункт
прейскуранта
ИсследованиеЦенаСрок
исполнения
(дней)
Идентификация, сравнение образцов (маркеры аутосом, Y-хромосомы, митохондриальной ДНК)
20.3.2Сравнительный анализ двух образцов по маркерам Y-хромосомы12 60014
20.5Сравнительный анализ двух образцов по аутосомным маркерам. Стандартная панель – 15 локусов12 60014
29.6.1Сравнительный анализ двух образцов по аутосомным маркерам. Расширенная панель – 25 локусов18 00014
22.2Анализ дополнительного образца по аутосомным маркерам. Стандартная панель – 15 локусов4 50014
25.2Анализ дополнительного образца по аутосомным маркерам. Расширенная панель – 25 локусов6 40014
22.3Анализ дополнительного образца по маркерам Y-хромосомы4 50014
22.5Анализ дополнительного образца по маркерам митохондриальной ДНК4 50021
20.4.2Сравнительный анализ двух образцов по маркерам митохондриальной ДНК12 60021
Типирование (маркеры аутосом, X-хромосомы, Y-хромосомы, митохондриальный ДНК)
23.1Типирование одного образца по аутосомным маркерам. Стандартная панель – 15 локусов4 50014
25.3Типирование одного образца по аутосомным маркерам. Расширенная панель – 25 локусов6 40014
23.2Типирование одного образца по маркерам X-хромосомы4 50014
23.3Типирование одного образца по маркерам Y-хромосомы4 50014
23.4Типирование одного образца по маркерам митохондриальной ДНК4 50021
Выделение ДНК из биологического материала (кроме крови и буккального эпителия)
28.1Выделение ДНК из биологического материала (кроме крови и буккального эпителия) (1 образец.)6 00014

Нуклеотидная последовательность полного генома каждого человека уникальна. Это свойство может быть использовано для идентификации. Однако, в настоящее время, секвенирование всего генома всё ещё представляет собой слишком дорогостоящую и длительную процедуру, чтобы его можно было рутинно использовать для целей идентификации человека. К счастью, не всё так плохо. Индивидуализирующими характеристиками обладает не только полногеномная нуклеотидная последовательность ДНК человека, но и его генотип по определенному, достаточно большому количеству, высокополиморфных учасков (локусов) генома.

В настоящее время для идентификации человека почти повсеместно используются так называемые STR-локусы. Аббревиатура STR происходит от английского словосочетания Short Tandem Repeat – дословно: короткий тандемный повтор. Локусы данного типа представляют собой цепочки, состоящие из небольших, длиной 2-6 нуклеотидов, одинаковых последовательностей (мономеров) или «повторов». Аллели данных локусов различаются между собой количеством этих повторов. STR-локусы имеют следующие преимущества:

  • Большое количество аллелей, что способствует снижению вероятности случайных совпадений генотипов разных людей.
  • Большое количество известных STR-локусов и их относительно равномерное распределение по всем хромосомам человека.
  • Возможность с помощью современных методов проводить быстрое, точное и недорогое типирование образцов по данным локусам.

Международным стандартом de facto стала система CODIS (COmbined DNA Index System), состоящая из 13 аутосомных STR-локусов (D3S1358, THO1, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, vWA, D8S1179, TPOX, FGA). Локусы данной системы подобраны так, что частота любого генотипа по ним настолько мала, что на всей Земле не может быть двух человек, имеющих один и тот же генотип по совокупности локусов системы CODIS.

В современных лабораториях генотипирование проводится автоматически с помощью аппаратно-программных комплексов, что позволяет унифицировать процедуру типирования и практически исключить влияние человеческого фактора.

На Рис. 1 показан пример представления результатов типирования человека аппаратно-программным комплексом 3130 Genetic Analyzer (фирма Applied Biosystems). Типирование проводится по системе локусов AmpFlSTR Identifiler (фирма Applied Biosystems), содержащей все локусы системы CODIS, дополнительные STR-локусы D2S1338 и D19S433, а также локус AMELOGENIN, по которому устанавливается половая принадлежность образца.

Рис. 1. Представление результатов типирования человека аппаратно-программным комплексом 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Полученный генетический профиль представляется в виде таблицы (Таблица 1):

Таблица 1. Пример представления результатов типирования человека (генотип соответствует представленному на Рис. 1).

ЛокусАллелиЛокусАллели
D8S11791014D2S13382323
D21S112930D5S8181213
D7S820910FGA2323
CSF1PO1011D19S4331415.2
D3S13581516vWA1516
THO199.3TPOX88
D13S317912D18S511417
D16S539912AMELOGENINXY

Зачем обычному человеку может понадобиться идентификационный анализ?

Могут возникнуть ситуации, когда необходимо установить происхождение биологического материала от конкретного человека. Это может понадобиться, например, для исключения ошибки в постановке диагноза при онкологических заболеваниях. Довольно часто в наш Центр обращаются люди, которым был поставлен диагноз онкологического заболевания, с просьбой проверить, действительно ли их биологический материал был использован при гистологическом исследовании. Нередко результаты идентификационного анализа говорят о том, что представленные гистологические образцы принадлежат не обратившемуся человеку, а другому лицу.

Люди, которые в силу своей профессиональной деятельности находятся в группе риска, наверняка захотят пройти генотипирование и получить свой уникальный генетический профиль.

Также возможны случаи, когда нужно провести молекулярно-генетическое исследование по установлению родства, но предполагаемые родственники живут в разных странах и не имеют возможности собраться вместе для проведения анализа.

Центр Молекулярной Генетики поможет Вам решить вышеупомянутые или аналогичные проблемы. Мы проводим сравнительный генетический анализ образцов по системам маркеров аутосом (включая систему CODIS), Y-хромосомы и митохондриальной ДНК, принятым в качестве международных стандартов. Результаты анализов, проведенных в лаборатории нашего Центра, будут понятны специалистам и могут быть использованы в лабораториях всего мира.

Центр Молекулярной Генетики имеет лицензии как на осуществление специализированной медицинской помощи по: генетике, лабораторной генетике, так и на проведение судебно-медицинской генетической экспертизы.

Ниже рассмотрены типичные случаи проведения сравнительных генетических анализов и генотипирования.

описание образца биологического материала от Ф.И.О. в род. падеже ?

Пункт прейскуранта: 4.20.5

Стоимость: 12600 руб.

Задача: Установить происхдят ли два образца биологического материала от одного и того же человека.

Исследуемый материал: два образца биологического материала.

Вопрос, выносимый на исследование: происходят ли описание образца биологического материала 1 и описание образца биологического материала 2 от одного и того же человека?

Пункт прейскуранта: 4.20.5

Стоимость: 12600 руб.

Задача: Получить генотип данного человека по маркерам системы CODIS с целью его дальнейшей идентификации

Исследуемый материал: образец биологического материала данного человека.

Задание, выносимое на исследование: получить генотип данного человека по маркерам системы CODIS.

Пункт прейскуранта: 4.23.1

Стоимость: 4500 руб.

Методы выделения, культивирования и идентификации вирусов

Лабораторные исследованияпри проведении идентификации вирусов и диагностике вирусных инфекций включают следующие этапы: выделение, культивирование, индикация (выявление) и идентификация вирусов.

2.3.1 Культивирование вирусов

Вирусы не растут на искусственных питательных средах, а размножаются только внутриклеточно. Крупным достижением было предложение Р. Гудпасчура в 1932 г. использовать для культивирования вирусов куриные эмбрионы. Окончательное решение проблемы культивирования вирусов оказалось возможным лишь после того, как были разработаны основные способы культивирования клеток вне организма.

Использование куриных эмбрионов. Куриные эмбрионы – практически идеальные модели для культивирования не­которых вирусов (например, гриппа и кори). Замкнутая полость эмбриона препятствует проник­новению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирова­ния и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса. Некоторые возбу­дители (например, герпесвирусы) вызывают характерные изменения (по ним можно распозна­вать заболевание).

Для заражения обычно используют куриные эмбрионы 7–12-дневного возраста. Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона путем овоскопирования (просматривают в проходящем свете). Живые эмбрионы при овоскопировании проявляют двигательную активность, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом очерчивают границы воздушной камеры.

Куриные эмбрионы заражают вируссодержащим материалом в асептических условиях стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом. Заражение проводят на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость, либо в желточный мешок (рисунок 29). Выбор метода заражения зависит от биологических свойств вируса.

Рисунок 29 – Схематическое изобра­жение развивающегося куриного эмбриона

Культура клеток. Вначале был использован метод переживающих тканей. Он заключался в том, что в колбу, содержащую питательную среду, вносили кусочек ткани. Клетки некоторых тканей в таких условиях могут пережи­вать (но не размножаться) до 30 дней, а в них могут размножаться вирусы. Однако этот способ давал очень небольшой выход вирусов. Необходимо было разработать условия, при которых клетки ткани могли бы свободно размножаться.

Для получения культур клеток необхо­димо было решить четыре главных задачи:

– получить в необходимом количестве свободные (т. е. изолированные друг от друга) клетки;

– создать такие питательные среды и условия, в которых клетки могли бы активно размножаться;

– обеспечить условия, при которых в культурах клеток не могли бы размножаться бактерии;

– определить методы, с помощью которых можно было бы распознавать рост вируса в культуре клеток и идентифицировать его.

Для выделения изолированных (разобщенных), но жизнеспособных клеток из разрушенных тканей, стали использовать обработку их слабым раствором трипсина, разрушающего межкле­точные мостики. Для культивирования клеток были предложены различные среды, содержащие все необходимые для размножения клеток питательные вещества (аминокислоты, основания, витамины и другие), минеральные соли, имеющие оптимальную рН и т. д. К питательным средам добавляли индикатор, по изменению цвета которого можно было судить о метаболизме клеток и их размноже­нии. Было установлено, что в качестве основы, на которой клетки размножаются и образуют монослой, может быть использовано хорошо обработанное стекло пробирок и колб. Для подавления возможного роста бактерий вируссодержащий материал перед посевом его в культуры клеток стали обраба­тывать антибиотиками.

В 1949 г. Дж. Эндерс, Т. Веллер и Ф. Роббинс показали, что вирус полиомиелита хорошо размножается в первично-трипсинизированных культурах клеток, полученных из почек обезьян. Основной недостаток первично-трипсинизированных клеток заключается в том, что после нескольких пересевов они перестают размножаться. Поэтому предпочтением стали пользоваться культуры таких клеток, которые способны размножаться in vitro бесконечно долго. Такие перевиваемые культуры клеток (клеточные линии характеризуются бессмертием и гетероплоидным кариотипом) получают из опухолевых тканей (HeLa получена из карциномы шейки матки, НЕр-2 – из карциномы гортани; Детройт-6 – из метастаза рака легкого в костный мозг; RН – из опухоли почки человека) или из мутантных клеток с полиплоидным набором хромосом. Однако опухолевые клетки нельзя применять для получения вакцин. Для этих целей используют только культуры таких клеток, которые не содержат никаких контаминантных вирусов и не обладают злокачественностью. Лучше всего этим требованиям отвечают культуры диплоидных клеток.

Полуперевиваемые (диплоидные) культуры клеток – клетки одного генотипа, способные in vitro выдерживать 50–100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин. Как оказалось, вирусы могут размножаться не только в культурах клеток, образующих монослой на стекле пробирок, но и в суспензиях живых клеток.

Для обеспечения жизнедеятельности культивируемых клеток необходимы питательные среды. По назначению они делятся на ростовые и поддерживающие. В ростовых питательных средах должно содержаться больше питательных веществ, обеспечивающих активное размножение клеток и формирование монослоя. Поддерживающие среды обеспечивают переживание клеток в уже сформированном монослое в период размножения в них вирусов.

2.3.2 Выделение вирусов

Выделение вирусов в культурах клеток. При выделении вирусов из различных инфекционных материалов (кровь, моча, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающих наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1–0,2 мл взвеси исследуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин контакта вируса с монослоем клеток удаляют избыток материала, в культуру вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

Выделение вирусов на лабораторных животных. При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили кле­точные культуры. Тем не менее животные модели активно используют для изучения особенно­стей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях.

Таким образом, для выделения чистых культур вирусов в лабораторных условиях в настоящее время используются следующие живые объекты (биологические модели): 1) культура клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные животные.

2.3.3 Индикация вирусов

Индикация вируса в курином эмбрионе. Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по образованию фокусных поражений («бляшек») на хорион-аллантоисной оболочке.

Индикация вирусов в культурах клеток. Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток может служить:

1) развитие специфической дегенерации клеток – цитопатическое действие вируса (ЦПД), имеющее три основных типа: крупно- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток (симпластов); развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток (гроздевидная дегенерация клеток).

Различают два механизма гибели клеток, вызываемой вирусами, – некроз и апоптоз. Некроз происходит из-за необратимых нарушений целостности клеточных мембран, апоптоз – вследствие фрагментации ядерной ДНК под действием клеточной эндонуклеазы.

Цитопатические эффектыоценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью:

2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток;

3) положительная реакция гемагглютинации (РГА) или гемадсорбции (РГАдс). Некоторые вирусы, в частности, вирус гриппа, обладают особыми рецепто­рами (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютинацию). Такие вирусы легко обнаруживаются с помощью реакции гемагглютинации или гемадсорбции (эритроциты адсорбируются на инфицированных вирусами клетках куль­туры тканей);

4) феномен бляшкообразования. Широкое распространение получил предложенный в 1952 г. Р. Дюльбекко метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное определение вирусов. Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной среды заражают вируссодержащим материалом и покрывают слоем агара, содержащего индикатор нейтральный красный. Чашки (флаконы) инкубируют при 37 °С. Через 48–96 ч выявляются пятна – бляшки. Они имеют диаметр 1–3 мм и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пятна возникают за счет цитопатического действия вируса;

5) цветная реакция Солка. О росте вирусов в клетках можно судить с помощью индикатора, добавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в желтый цвет. В случае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраняет первоначальный (малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оранжевый;

6) реакция интерференции (используется при отсутствии ЦПД, гемагглютинации и гемадсорбции): исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительна). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

Кроме того, для обнаружения вируса в культурах клеток могут быть использованы различные серологические реакции.

Индикация вирусов на лабораторных животных. Индикация вируса основана на обнаружении у животных признаков инфекционного заболевания, регистрации их гибели, изучении характера патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, выявлении положительной реакции гемагглютинации.

2.3.4 Методы идентификации вирусов

Определение типа вируса (его идентификация) основано на нейтрализации биологической активно­сти вируса с помощью типоспецифических сывороток. Конечный результат ее может быть установлен на основании следующих признаков:

1) нейтрализация цитопатического действия: в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1–2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус. При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим антителам примененной сыворотки;

2) нейтрализация реакции гемадсорбции;

3) изменение проявления цветной пробы;

4) задержка (торможение) реакции гемагглютинации: смешивают культуральную среду, со­держащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.

5) нейтрализация в опытах на животных.

Таким образом РН (реакция нейтрализации) основана на подавлении соответствующей реакции, феномена, развития инфекционного процесса после внесения в культуру или введения в организм животного смеси вируса со специ­фичными AT, содержащимися в диагностической сыворотке.

Вопросы для самоконтроля

1 Назовите основные принципы классификации вирусов.

2 Приведите русские и латинские названия основных семейств вирусов человека и животных.

3 Назовите типовых представителей основных семейств вирусов и заболевания, вызываемые ими.

4 Каковы особенности морфологии и ультраструктуры вирусов человека и животных (основных семейств)?

5 Назовите РНК-геномные и ДНК-геномные фитовирусы.

6 Какие этапы включают в себя лабораторные исследования при идентификации вирусов и диагностике вирусных инфекций?

7 Какие биологические модели используются для выделения и культивирования вирусов человека и животных?

8 Как происходит заражение куриных эмбрионов в лабораторных условиях?

9 Какие методы получения культуры клеток вы знаете?

10 Как проводят идентификацию вирусов в курином эмбрионе и на лабораторных животных?

11 Какие существуют методы индикации вирусов на культуре клеток?

12 В чем заключается назначение и сущность реакций нейтрализации вирусов?

13 Назовите способы постановки реакций нейтрализации вирусов.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Студент – человек, постоянно откладывающий неизбежность. 11361 – | 7610 – или читать все.

Изолирование метформина из биологического материала и его идентификация

Publication in electronic media: 22.10.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/395
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и права, Казань 2010 Вып. 1

В практике судебно-химического отделения имел место случай отравления препаратом «Сиофор» (действующее вещество – метформина гидрохлорид). Метформин (синонимы: Глиформин, Глюкофаг, Диформин, Diaberil, Diabetosan, Diabexil, Diformin, Diguanid, Glycoran, Melbin и др.) – N, N-диметилбигуанид:

представляет собой белый кристаллический порошок, легко растворимый в воде, растворимый в спирте, практически нерастворимый в хлороформе, эфире [1].

Метформин относится к синтетическим пероральным гипогликемическим (антидиабетическим) препаратам группы бигуанидов. Наибольший гипогликемический эффект наступает через 4-5 ч после применения препарата. Метформин применяют при лечении сахарного диабета 2 типа у взрослых в сочетании с инсулином при инсулинорезистентных формах диабета. Назначают внутрь во время или непосредственно после еды, начиная с 0,25-0,5 до 0,5-0,75 г 2-3 раза в день. Препараты группы гуанидинов (метформин, биформин, фенформин) были созданы и клинически использованы как пероральные гипогликемические средства в Европе в 1970 году. Однако, как отмечают зарубежные авторы, в 1977 году фенформин был запрещен к применению в Соединенных Штатах из-за его склонности вызывать серьезный молочный ацидоз.

Фармакокинетика. Метформин медленно всасывается после орального применения, практически не сязывается с белками крови. От 30 до 50% перо-ральной дозы его выводится с мочой в неизмененном виде в течение 24 часов и 30% в неизмененном виде с калом. Период полураспада метформина в среднем 6 часов. Биодоступность 50-60%. Отмечается, что после приема однократной пероральной дозы 500 мг пятерыми пациентами концентрация метформина в плазме их крови через 1-3 часа составила 1,0-2,3 мг/л. После приема однократной пероральной дозы 1500 мг у четверых из пяти пациентов концентрация метформина в плазме через 1,5 часа составила 3,1 мг/л. Максимальная концентрация в плазме не увеличивалась при длительном применении препарата, а концентрация в моче достигает 1600 мг/л [3].

Токсичность. В зарубежной литературе описаны 3 случая развития молочного ацидоза и вторичных почечных осложнений при длительном применении метформина, при этом концентрация метформина в плазме составила 45- 70 мг/л и пациентам назначали гемодиализ и форсированный диурез. После приема мужчиной 24 г метформина с суицидальной целью у него развился метаболический ацидоз, больной впал в кому (концентрация метформина в плазме составила 110 мг/л), смерть наступила через 40 часов.

В доступной нам литературе мы не встретили данных о методах изолирования метформина из биологического материала и его идентификации, поэтому судебно-химическое исследование проводилось экспериментальным путем.

Экспериментальная часть

  1. Изолирование метформина гидрохлорида из таблеток. 2 таблетки «Сиофор» по 500 мг измельчали в ступке, смешивали с водой, извлекали из кислой среды при рН=2 смесью хлороформ-эфир (2:1) и из щелочной среды при рН=9 хлороформом.
  2. Исследование биологического материала. Исходя из физико-химических свойств метформина, для изолирования были использованы два метода: а) подкисленной водой; б) подкисленным спиртом по Стассу-Отто.

Для идентификации выделенного метформина в биологическом материале использованы: хроматография в тонком слое сорбента, реакции окрашивания, спектрофотометрия в ультрафиолетовой области, высокоэффективная жидкостная хроматография. Из-за термолабильности метформина использование хромато-масс-спектрометрии и газовой хроматографии не представилось возможным.

Для хроматографии в тонком слое сорбента использованы хроматографические пластинки «Сорбфил-ПТСХ-П-А».

Таблица 1. Коэффициент распределения метформина в различных системах растворителей

№ пп.Системы растворителейRf
1Этилацетат – метиловый спирт – 25% раствор аммиака (85:10:5)0,0
2Хлороформ – ацетон – диоксан – 25% раствор аммиака (45-5-47,5-2,5)0,0
3Хлороформ – метиловый спирт (90-10)0,0
4Циклогексан – толуол – диэтиламин (75-15-10)0,45
5Метиловый спирт – 25% раствор аммиака0,1

Лучшее разделение наблюдали в системе растворителей циклогексан – толуол – диэтиламин (75-15-10).

В качестве проявителей использовали: 1) подкисленный раствор йодплатината; 2) реактив Драгендорфа в модификации Мольдавера; 3) последовательно 10% раствор сульфата меди (II) и 10% раствор аммиака; 4) 10% раствор гексацианоферрата калия (II).

Таблица 2. Результаты окрашиваний

№ пп.Проявитель (реактив)Окрашивание
1Подкисленный раствор йодплатинатаКоричневое
2Реактив Драгендорфа в модификации МольдавераОранжевое
3Последовательно 10% раствор сульфата меди (II) и 10% раствор аммиакаГолубое, переходящее в пурпурно-красное
410% раствор гексацианоферрата калия (II)Белое

Выполнение реакции окрашивания (реакция Сакагучи на гуанидин). К аликвоте извлечений при рН=9 при охлаждении во льду прибавляли 1 мл 5% раствора едкого натра и 2 капли 1% спиртового раствора а-нафтола. Затем прибавляли 10 капель раствора гипобромита (свежеприготовленный раствор 2 г брома в 100 мл 5% раствора едкого натра). Наблюдали появление красной окраски. В качестве контрольного раствора использовали извлечение при рН=9 из таблеток «Сиофор», «холостого» раствора – хлороформ [2].

Для идентификации метформина, выделенного из биологического материала и таблеток «Сиофор», снимали спектр поглощения остатков извлечений из щелочной среды в метаноле на спектрофотометре HP «Хьюлетт-паккард» в интервале длин волн 220-400 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Наблюдали максимум поглощения метформина при 236 нм.

Идентификацию метформина (рис. 1) методом высокоэффективной жид-костной хроматографии проводили на хроматографе фирмы «Agilent Technologies» 1100 Series со спектрофотометрическим детектором на стандартной колонке из нержавеющей стали длиной 25 см с диаметром 4,6 мм, заполненной обращенно-фазным сорбентом Zorbax SB-С 18 (5 мкм). Температура колонки 25 °С. В качестве подвижной фазы был выбран раствор 0,01 М ацетата аммония в ацетонитриле в соотношении (35:65). Скорость элюирования 1 мл/мин. Детектирование проводили при длинах волн 220, 230, 236 и 254 нм. Вводимая доза 20 мкл. Время выхода метформина гидрохлорида при длине волны 236 нм 3,165 минуты. Исследование аликвоты извлечений при рН=9 проводили при той же длине волны, время выхода составило 3,174 минуты.


Рис. 1. Спектр метформина.

Согласно Кларку, минимально детектируемая концентрация метформина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в плазме 2,5 мг [4].

Добавить комментарий